蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量快速檢測的方法
多年來，蔬菜中農(nóng)藥殘留超標(biāo)的情況一直較突出，農(nóng)藥中毒事件常有報(bào)道。究其原因，一是農(nóng)戶不按規(guī)定的用藥量、次數(shù)、方法或安全間隔期施藥，或施用不允許在蔬菜上使用的劇毒、高毒農(nóng)藥；二是現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)施行的農(nóng)藥殘留測定需要通過有機(jī)溶劑提取、凈化和用大型分析儀器進(jìn)行，無法對廉價(jià)的蔬菜進(jìn)行隨時(shí)隨地或快速的檢測而形成的監(jiān)管不到位。加強(qiáng)對農(nóng)戶的宣傳指導(dǎo)和建立適合我國國情的、規(guī)范化的農(nóng)藥殘留快速檢測方法，是解決問題的關(guān)鍵所在。
目前所使用的農(nóng)藥按其化學(xué)結(jié)構(gòu)大致可分為以下幾類：有機(jī)氯類，有機(jī)磷類，氨基甲酸酯類，擬除蟲菊酯類等。在我國農(nóng)藥中，70%為有機(jī)磷農(nóng)藥，而在我國生產(chǎn)使用的有機(jī)磷農(nóng)藥中，70％為劇毒、高毒類，而且較多是禁止在蔬菜作物上使用的。
根據(jù)以上情況，制定出有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的快速檢測方法，使其不受時(shí)間、地點(diǎn)、場合等條件限制，甚至普通消費(fèi)者也能夠操作使用，有利于及時(shí)發(fā)現(xiàn)問題、采取措施，控制高殘留農(nóng)藥蔬菜的攝入，降低農(nóng)藥中毒發(fā)生率，保障消費(fèi)者食菜安全。
1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了由酶抑制法測定蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留量的快速檢驗(yàn)方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的快速篩選測定。
2 原理
膽堿酯酶可催化靛酚乙酸酯（紅色）水解為乙酸與靛酚（藍(lán)色），有機(jī)磷或氨基甲酸脂類農(nóng)藥對膽堿酯酶有抑制作用，使催化、水解、變色的過程發(fā)生改變，由此可判斷出樣品中是否含有有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的存在。
3 試劑
3.1固化有膽堿酯酶和靛酚乙酸酯試劑的紙片（速測卡）。
3.2pH7.5緩沖溶液：分別取15.0g磷酸氫二鈉[Na2HPO4·12H2O]與1.59g無水磷酸二氫鉀[KH2PO4]，用500mL蒸餾水溶解。
4 儀器
4.1常量天平有條件時(shí)配備37℃±2℃恒溫裝置
5 分析步驟
5.1整體測定法
5.1.1選取有代表性的蔬菜樣品，擦去表面泥土，剪成1cm左右見方碎片，取5g放入帶蓋瓶中，加入10mL緩沖溶液，震搖50次，靜置2min以上。
5.1.2取一片速測卡，用白色藥片沾取提取液，放置10min以上進(jìn)行預(yù)反應(yīng)，有條件時(shí)在37℃恒溫裝置中放置10min。預(yù)反應(yīng)后的藥片表面必須保持濕潤。
5.1.3將速測卡對折，用手捏3min或用恒溫裝置恒溫3min，使紅色藥片與白色藥片疊合反應(yīng)。
5.1.4每批測定應(yīng)設(shè)一個(gè)緩沖液的空白對照卡。
5.2表面測定法（粗篩法）
5.2.1擦去蔬菜表面泥土，滴2~3滴緩沖溶液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液處輕輕摩擦。
5.2.2取一片速測卡，將蔬菜上的液滴滴在白色藥片上。
5.2.3放置10min以上進(jìn)行預(yù)反應(yīng)，有條件時(shí)在37℃恒溫裝置中放置10min。預(yù)反應(yīng)后的藥片表面必須保持濕潤。
5.2.4將速測卡對折，用手捏3min或用恒溫裝置恒溫3min，使紅色藥片與白色藥片疊合反應(yīng)。
5.2.5每批測定應(yīng)設(shè)一個(gè)緩沖液的空白對照卡。
6 結(jié)果判定
上面為陽性結(jié)果下面為陰性結(jié)果
結(jié)果以酶被有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥抑制（為陽性）、未抑制（為陰性）表示。與空白對照卡比較，白色藥片不變色或略有淺藍(lán)色均為陽性結(jié)果。白色藥片變?yōu)樘焖{(lán)色或與空白對照卡相同，為陰性結(jié)果。對陽性結(jié)果的樣品，可用其它分析方法進(jìn)一步確定具體農(nóng)藥品種和含量。
7 附則
7.1速測卡技術(shù)指標(biāo)
7.1.1靈敏度指標(biāo)：速測卡對部分常見農(nóng)藥的檢出限及我國*見表1。
表1部分常見農(nóng)藥的檢出限（mg/kg）及大殘留*（mg/kg）
農(nóng)藥名稱檢出限殘留*農(nóng)藥名稱檢出限殘留*
甲胺磷1.7不得檢出敵敵畏0.30.2
對硫磷1.7不得檢出敵百蟲0.30.1
水胺硫磷3.1不得檢出樂果1.31.0
馬拉硫磷2.0不得檢出西維因2.52.0
久效磷2.5不得檢出好年冬1.0不得檢出
乙酰甲胺磷3.50.2呋喃丹0.5不得檢出
7.1.2符合率：在檢出的30份以上陽性樣品中，經(jīng)氣相色譜法驗(yàn)證，陽性結(jié)果的符合率應(yīng)在80%以上。
8 說明
8.1蔥、蒜、蘿卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有對酶有影響的植物次生物質(zhì)，容易產(chǎn)生假陽性。處理這類樣品時(shí)，可采取整株（體）蔬菜浸提或采用表面測定法。對一些含葉綠素較高的蔬菜，也可采取整株（體）蔬菜浸提的方法，減少色素的干擾。
8.2當(dāng)溫度條件低于37°C，酶反應(yīng)的速度隨之放慢，藥片加液后放置反應(yīng)的時(shí)間應(yīng)相對延長，延長時(shí)間的確定，應(yīng)以空白對照卡用（體溫）手指捏3分鐘時(shí)可以變藍(lán)，即可往下操作。注意樣品放置的時(shí)間應(yīng)與空白對照卡放置的時(shí)間一致才有可比性。空白對照卡不變色的原因：一是藥片表面緩沖溶液加的少、預(yù)反應(yīng)后的藥片表面不夠濕潤，二是溫度太低。
方法二酶抑制率法（分光光度法）
9 原理
在一定條件下，有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對膽堿酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率與農(nóng)藥的濃度呈正相關(guān)。正常情況下，酶催化神經(jīng)傳導(dǎo)代謝產(chǎn)物（乙酰膽堿）水解，其水解產(chǎn)物與顯色劑反應(yīng)，產(chǎn)生黃色物質(zhì)，用分光光度計(jì)在412nm處測定吸光度隨時(shí)間的變化值，計(jì)算出抑制率，通過抑制率可以判斷出樣品中是否有高劑量有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的存在。
10 試劑
10.1pH8.0緩沖溶液：分別取11.9g無水磷酸氫二鉀與3.2g磷酸二氫鉀，用1000mL蒸餾水溶解。
10.2顯色劑：分別取160mg二硫代*甲酸（DTNB）和15.6mg碳酸氫鈉，用20mL緩沖溶液溶解，4°C冰箱中保存。
10.3底物：取25.0mg硫代乙酰膽堿，加3.0mL蒸餾水溶解，搖勻后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩１４嫫诓怀^兩周。
10.4乙酰膽堿酯酶：根據(jù)酶的活性情況，用緩沖溶液溶解，3min的吸光度變化DA0值應(yīng)控制在0.3以上。搖勻后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫４嫫诓怀^四天。
10.5可選用由以上試劑制備的試劑盒。乙酰膽堿酯酶的DA0值應(yīng)控制在0.3以上。
11 儀器
11.1分光光度計(jì)或相應(yīng)測定儀及常量天平。
12 分析步驟
12.1樣品處理：選取有代表性的蔬菜樣品，沖洗掉表面泥土，剪成1cm左右見方碎片，取樣品1g，放入燒杯或提取瓶中，加入5mL緩沖溶液，振蕩1~2min，倒出提取液，靜置3~5min，待用。
12.2對照溶液測試：先于試管中加入2.5mL緩沖溶液，再加入0.lmL酶液、0.1mL顯色劑，搖勻后于37°C放置15min以上（每批樣品的控制時(shí)間應(yīng)一致）。加入0.lmL底物搖勻，此時(shí)檢液開始顯色反應(yīng)，應(yīng)立即放入儀器比色池中，記錄反應(yīng)3min的吸光度變化值DA0。
12.3樣品溶液測試：先于試管中加入2.5mL樣品提取液，其它操作與對照溶液測試相同，記錄反應(yīng)3min的吸光度變化值DAt。
13 結(jié)果的表述計(jì)算
13.1結(jié)果計(jì)算
檢測結(jié)果按公式計(jì)算：抑制率(%)=[(DA0-DAt)/DA0]×100
式中：DA0棗對照溶液反應(yīng)3min吸光度的變化值；DAt棗樣品溶液反應(yīng)3min吸光度的變化值；
13.2結(jié)果判定
結(jié)果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。當(dāng)蔬菜樣品提取液對酶的抑制率≥50%時(shí)，表示蔬菜中有高劑量有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥存在，樣品為陽性結(jié)果。陽性結(jié)果的樣品需要重復(fù)檢驗(yàn)2次以上。對陽性結(jié)果的樣品，可用其它方法進(jìn)一步確定具體農(nóng)藥品種和含量。
14 附則
14.1酶抑制率法技術(shù)指標(biāo)
14.1.1靈敏度指標(biāo)：酶抑制率法對部分農(nóng)藥的檢出限見表2酶抑制率法對部分農(nóng)藥的檢出限
農(nóng)藥名稱檢出限mg/kg農(nóng)藥名稱檢出限mg/kg
敵敵畏0.1氧化樂果0.8
對硫磷1.0甲基異柳磷5.0
辛硫磷0.3滅多威0.1
甲胺磷2.0丁硫克百威0.05
馬拉硫磷4.0敵百蟲0.2
樂果3.0呋南丹0.05
14.1.2符合率：在檢出的抑制率≥50%的30份以上樣品中，經(jīng)氣相色譜法驗(yàn)證，陽性結(jié)果的符合率應(yīng)在80%以上。
15 說明
15.1蔥、蒜、蘿卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有對酶有影響的植物次生物質(zhì)，容易產(chǎn)生假陽性。處理這類樣品時(shí)，可采取整株（體）蔬菜浸提。對一些含葉綠素較高的蔬菜，也可采取整株（體）蔬菜浸提的方法，減少色素的干擾。
15.2當(dāng)溫度條件低于37°C，酶反應(yīng)的速度隨之放慢，加入酶液和顯色劑后放置反應(yīng)的時(shí)間應(yīng)相對延長，延長時(shí)間的確定，應(yīng)以膽堿酯酶空白對照測試3min的吸光度變化DA0值在0.3以上，即可往下操作。注意樣品放置時(shí)間應(yīng)與空白對照溶液放置時(shí)間一致才有可比性。膽堿酯酶空白對照溶液3min的吸光度變化DA0值＜0.3的原因：一是酶的活性不夠，二是溫度太低。
15.3當(dāng)吸光度大到無法讀取時(shí)，說明測定液渾濁有干擾。
16方法注釋
16.1兩種方法的共同點(diǎn)：以上兩種方法的原理、緩沖（提取）溶液pH值、測定中的干擾物質(zhì)和排除方法基本相同。
16.2速測卡法的檢出限：方法文本中的表1，是由衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所、廣東省食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所、北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所、香港政府化驗(yàn)所、廣東省農(nóng)藥檢定所、深圳市衛(wèi)生防疫站、華南農(nóng)大昆蟲毒理研究室七個(gè)單位，使用速測卡法，對我國常見使用的一些有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢出限的實(shí)驗(yàn)與驗(yàn)證數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)表。從表1可以看出，在使用速測卡法檢出蔬菜樣品為農(nóng)藥陽性時(shí)，即可視為有機(jī)磷或氨基甲酸酯類的農(nóng)藥已超標(biāo)。在有條件的單位，可用氣相色譜儀或質(zhì)譜儀對陽性試樣進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來確定是哪種農(nóng)藥、確切含量。
16.3酶抑制率法的選擇：在氣相色譜分析儀還未問世及分布較少時(shí)，對有機(jī)磷類農(nóng)藥的檢測即采取了酶抑制分光光度法，只是由于當(dāng)時(shí)酶的純度不夠高、靈敏度較低、酶試劑保存期短、及方法不能區(qū)分出具體的農(nóng)藥而被氣相色譜法所取代。而今用其作為快速分析則恰到好處。只是現(xiàn)在酶試劑的質(zhì)量還應(yīng)進(jìn)一步提高，有效保存期應(yīng)設(shè)法延長。由于這兩個(gè)現(xiàn)實(shí)情況，在實(shí)驗(yàn)前，必需測試酶的活性，達(dá)到要求后才能往下進(jìn)行。
16.4速測卡法操作簡單、使用方便，常溫下試藥的有效期可達(dá)一年。酶抑制率光度法與速測卡法比較操作要煩瑣些，夏天時(shí)，試藥需要冷藏運(yùn)輸，但以數(shù)字形式讀取數(shù)據(jù)，較為直觀。
